三、基因组表达

• 基因型（Genotype）：一个机体的遗传内容，也就是所具有的全部基因。基因型可能不同于它所表现出来的性状和特征（表型）
• 基因定位和基因组测序：是正确表达遗传信息和绘制遗传图谱的方法。如，“全基因组鸟枪测序”法。（p225）
• cDNA文库：是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。
• 基因文库（genomic library）

是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。
第二节 转录水平的调控 ????????????????????????????????????
一、DNA结合蛋白
1、蛋白质与核酸的相互作用
pro 和Nu的相互作用对复制、转录、翻译及这些过程的调控是非常重要的。
两种类型：
非专一性：蛋白质可以结和到核酸的任何部位。如组蛋白。
专一性： 蛋白质结合到特定序列的核酸部位。如阻遏蛋白是由两条相同多肽链组成的蛋白质二聚体，每一条多肽链与双链DNA中的一条发生序列专一性结合。
2、结合蛋白质的结构
常见结构形式
螺旋—转角—螺旋（helix-turn-helix) HTH
锌指 (zinec finger)
亮氨酸拉扣 (leucine zipper)

Helix-turn-helix motif与DNA结合
(识别螺旋在DNA大沟中)
CAP二聚体的HTH motif依次在DNA大沟上接触
两个Cys-两个His锌指结构
TFIIIA锌指与5S DNA结合模型
Zinc finger的NMR结构
Zinc finger的X-射线结构
二聚体化转录因子C/EBP的亮氨酸拉链和DNA结合结构域的结构模型
Leucine zipper motif
Leucine zipper区与DNA复合物的X-射线结构
HLH与DNA复合物的X-射线结构
二、操纵子的转录调控

• 操纵子：原核生物细胞中，功能相关的基因组成操纵子结构，由操纵区同一个或几个结构基因联合，形成一个在结构、功能上协同作用的整体，受同一调节基因和启动区的调控。
• 调节基因：通过产生阻遏物或激活物来调节操纵区，从而控制结构基因的功能。
• 启动子：是RNA聚合酶和CAP蛋白的结合位点，控制着结构基因的功能。

原核生物转录水平的基因调控：

• 根据调控机制分为：

负转录调控（negative transcription control)
调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor),起着阻止结构基因转录的作用，阻遏蛋白作用的部位是操纵区。又分为负控诱导和负控阻遏。
正转录调控（positive transcription control)
调节基因的产物是激活蛋白（activator protein)
激活蛋白的作用部位是离启动区很近的激活位点，对启动区起正的作用。由效应物分子的存在控制激活蛋白的状态。分正控诱导和正控阻遏。
1、负控诱导系统
大肠杆菌的lac i 基因与乳糖操纵子（lactose operon)的作用是负控诱导系统。
2、负控阻遏系统
大肠杆菌色氨酸操纵子（tryptophan operon)含有5个结构基因，编码色氨酸生物合成途径中的各种酶。
转录是通过操纵区和阻遏蛋白控制的，效应物是trp，即trp 操纵子的基因编码的生物合成途径中的末端产物。
色氨酸不足时，阻遏物失去trp，从操纵区解离；存在时，trp结合到游离的阻遏物上诱发变构转换，使阻遏物紧紧结合到操纵区。
例： E.coli 乳糖操纵子学说(负控诱导调节)

• 无乳糖时：细胞内产生的阻遏物结合在操纵基因上,转录不能进行；

E.coli色氨酸操纵子Trp Operon（负控阻遏系统）

• Trp Operon含有5个结构基因，编码色氨酸生物合成途径中的各种酶。调控催化色氨酸生物合成相关五个酶的合成。
• Trp Operon是一个可阻遏操纵子：当trp缺乏时，trp Operon调节转录；当trp存在时，阻遏蛋白与trp的复合物结合在操纵基因上阻止RNA多聚酶的转录。
• Trp Operon的弱化作用，弱化现象的转录调节是普遍现象 。

trp Operon的弱化作用(Attenuation)

• 是细菌辅助阻遏作用的精细调控。
• 弱化子：即先导肽（或称前导肽）—一条末端含有多个色氨酸的多肽链。
• 弱化现象：由操纵子的前导区内类似于终止结构的一段DNA序列而实现，不过这种终止作用并不使正在转录中的mRNA全部都中途终止，而仅有部分中途停止转录。

前导顺序的结构特点
弱化作用的产生
弱化现象的转录调节是普遍现象
3、正控诱导系统

• 调节蛋白为激活蛋白，促进RNA聚合酶的结合，从而增加mRNA的合成。

大肠杆菌麦芽糖操纵子的调控，麦芽糖是诱导物。
麦芽糖正控诱导系统

三、分解代谢物阻遏调控

• 分解代谢物阻遏中，只有当一种称为分解物激活蛋白(CAP)首先结合到启动子上游后，RNA聚合酶才能与启动子结合。
• cAMP是多种调控系统的重要因素，分解代谢物阻遏实际是cAMP缺少的结果。即信号酶cAMP- CAP调节了操纵子。 cAMP- CAP复合物是不同于阻遏物的正调控因子。
• 葡萄糖效应：葡萄糖存在能抑制cAMP形成并促进cAMP分泌到胞外，

1）cAMP与CAP结合；
2）cAMP与CAP复合物结合在启动子上，RNApolase才与启动子结合，转录进行。
3）缺少cAMP和CAP时，RNApolase不能与启动子结合。
有葡萄糖： cAMP的产生受葡萄糖抑制。
葡萄糖降解物抑制腺苷酸环化酶的活性，cAMP浓度下降 ，cAMP不与CAP结合，RNA多聚酶不能结合， 转录不能进行。
无葡萄糖： cAMP浓度上升，cAMP与CAP(降解物的激活蛋白)结合,与启动基因结合，转录进行.。
CAP-cAMP复合物X-射线结构
CAP二聚体结构
四、细菌的应急反应

• 当氨基酸匮乏时，停止各种RNA（特别是rRNA）在内的几乎全部生物化学反应过程。只维持生命最低限量的需要。
• 实施应急反应信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)。
• 产生2种应急反应信号的诱导物是空载tRNA。

ppGpp是超级调控因子。不仅影响1个或几个操纵子，而是一大批；不只是调控转录而也具调控翻译。
tRNA分子的共同特征
tRNA X射线晶体图
五、信号传导和二组分调节系统

• 信号传导两种方式：一是通过环境中的小分子效应物直接与调节蛋白结合进行转录调控的过程；二是外部信号通过传感器（sensor）检测到信号，以变化的形式传到调节部位的过程。
• 二组分调节系统（two-component systems） 由2种不同的蛋白质组成：位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor protein）又称传感激酶和位于细胞质中的应答调节蛋白（response regulator protein）

.
该系统中必须有磷酸酶参入，以移去磷酸化的应答调节蛋白（阻遏蛋白）磷酸基团。

• 调节机理：传感激酶与膜外环境的信号反应过程中，经磷酸化，磷酰基团后，转移到应答调节蛋白上，磷酸化的应答调节蛋白即成为阻遏蛋白，通过对操纵子的阻遏作用进行调控。

六、σ（sigma factor）因子的调控

• 是RNA聚合酶核心酶与启动子之间的桥梁，参与启动子的识别和结合。如枯草杆菌通过σ因子更换，使RNA聚合酶识别不同基因的启动子，使与孢子形成有关的基因有序地表达，认为至少有6个σ因子和80多个基因参与；而大肠杆菌没有σ因子更换现象。

第二节、转录后调控 ?????????????????????????????????????
是对转录调控的补充，是翻译和翻译后水平的“微调”。

• 翻译起始的调控

受 RBS和mRNA的二级结构的影响。
RBS：是指起始密码子AUG上游30-40核苷酸的一段非译区。既起始于mRNA上的核糖体结合位点。其结合强度取决于SD序列的结构与AUG 之间的距离，一般以4~10核苷酸为佳。
SD(Shine-Dalgamo)序列：长度为5个核苷酸，富含G、A，功能是与核糖体16S rRNA的3’端互补配对，使核糖体结合到mRNA上。以利翻译的起始。
mRNA的二级结构也是翻译起始调控的重要因素 ：

• 核糖体的30亚基与mRNA的靠近，要求mRNA 5’端有一定的空间结构，这一空间的改变与SD序列上游的碱基以及mRNA与核糖体结合的-20至+40的区域有关。

其中任何核甘酸的微小变化，会影响表达效率的差异。
二、mRNA的稳定性

• 基因的表达量与mRNA半衰期成正比例关系。
• 胞外酶的mRNA相对比较稳定，半衰期比较长。
• 不同蛋白质的mRNA的稳定性相差很大。可以从几秒到几十分钟。

三、稀有密码子和重叠基因调控
1、稀有密码子（rare codons）：不同tRNA含量上的差异，产生了对密码子的偏爱性，对应tRNA稀少的密码子。其表达效率低，主要反应在对同一操纵子中不同基因表达量的控制。
2、重叠基因：认为在有限的DNA序列中，得到多种蛋白质，可能对基因表达有调控作用。
四、反义RNA调控

• 反义基因：编码反义RNA的基因。
• 调节作用涉及质粒的复制、转座作用、渗透调节等，以及cAMP受体蛋白的基因的表达等。
• 反义RNA能专一性结合到mRNA并阻止其活性，即阻止基因表达。

原核生物和真核生物mRNA结构的比较
五、翻译的阻遏调控

• 实验证明，纯化的复制酶可以和外壳蛋白的翻译起始区结合，抑制蛋白质的合成。
• 微生物的转录水平的调控是蛋白质或小分子物质对基因转录的阻遏或激活，在翻译水平上发现了类似蛋白质（认为是复制酶）阻遏作用。

六、ppGpp对核糖体蛋白质合成的影响

• 核糖体是由rRNA和核糖体蛋白质构成，是翻译遗传密码的唯一场所。
• ppGpp对转录的调控，即在氨基酸短缺时，首先被停止合成的是rRNA。 rRNA的合成是转录水平的调控。
• 当rRNA短缺时，多余的核糖体蛋白质与自身的mRNA结合，从而阻断本身的翻译，也阻断了同一多顺反子的mRNA下游其他核糖体蛋白质编码区的翻译，使核糖体蛋白质的合成和rRNA的合成几乎同时停止。
• 核糖体

真核生物与原核生物核糖体的比较越来越多的证据表明，在核糖体许多催化反应中rRNA起主要作用。
2、原核生物蛋白质合成的三个过程
起始、延伸、终止
起始：起始因子IF1、IF2和IF3
mRNA上的核糖体结合位点(RBS)含Shine-Dalgarno顺序和(S.D顺序)；
使核糖体与mRNA在特定位点结合，形成30s起始复合物
70s起始复合物的形成
延伸：延伸因子 EF-Tu EF-Ts EF-G
延伸的三个步骤
结合 氨酰-tRNA与A位点的结合
延伸因子(EF-Tu和EF-Ts)参与结合反应的循环过程
转肽 肽键的形成(23s rRNA催化)
移位 肽基-tRNA从A位转移到P位
无负载tRNA释放
mRNA上下一个密码子进入A位
EF-G因子参与
延伸因子Tu(EF-Tu)的循环
肽键的形成
大肠杆菌核糖体上蛋白质合成延伸阶段
终止
没有tRNA形式可以正常识别终止密码子
三种释放因子 RF1 RF2 RF3
RF1识别UAA、UAG
RF2识别UAA、UGA
核糖体在mRNA上阅读方向5’ → 3’
蛋白质合成方向从氨基 → 羧基
大肠杆菌核糖体上蛋白质合成的终止过程
3、真核生物的蛋白质生物合成
真核生物与原核生物蛋白质合成许多不同机制主要发生在起始阶段
真核起始tRNA不需甲酰化
真核40s核糖体亚基结合在mRNA的5’-帽子区，沿mRNA扫描直至
找到合适的AUG
真核生物使用更为复杂起始因子系统(至少有九种起始因子与起始相关)
核糖体结合实验
真核生物核糖体组成
新生蛋白质的修饰与加工(翻译后修饰)
氨基末端和羧基末端的修饰
信号肽酶从新生蛋白质除去信号肽
蛋白酶水解
二硫键形成
氨基酸残基修饰
延伸
延伸因子 eEF-1a
eEF-1b
eEF-1g和eEF-2

终止
只有一种释放因子eRF识别所有三种终止密码子
4、多核糖体(Polyribosome)
数个或数十个核糖体同时在一条mRNA上进行翻译而联系在一起的结构
细胞通过多核糖体的方式合成蛋白质，大大提高了mRNA的效率
原核生物中转录和翻译是紧密偶联的。在转录完成之前，核糖体就从mRNA5’末端开始翻译。
真核生物转录的mRNA加工为成熟mRNA，从核转运到细胞质开始翻译
七、细菌蛋白质的分泌调控

• 能分泌到胞外的蛋白质统称为分泌蛋白。
• 分泌蛋白质N-末端含有 一段15~30个疏水氨基酸残基组成的信号肽（signal peptide）。大多数分泌蛋白都有信号肽，尤其是G-。
• 疏水性信号肽对于新生肽链跨越膜及把它固定在膜上起了一个拐棍作用，信号肽在完成功能后，随即被一种特异的信号肽酶（signalase）水解。

原核生物核糖体组成
真核生物核糖体组成

• 分泌的启动和抑制调控与一种信号识别颗粒（signal recognation particle ，简称 SRP）有关。
• SRP能与核糖体结合，并停止蛋白质合成，对翻译起负调节作用。
• 信号肽和SRP的共同作用下，使分泌蛋白能及时完成转运和分泌，避免在细胞内的积累。

生物大分子的立体结构

• 生物大分子在线性或环状结构基础上，通过分子内或分子之间的基团（包括极性、非极性和带电荷基团）相互作用，可以进一步形成非常复杂的立体结构。例如盘绕成螺旋形，折叠成片层状。有的以线状存在，而有的则形成球状等。

第十一章 微生物与基因工程
基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指对遗传信息分子操作和施工，把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，使生物表现出新的形状来。
第一节、基因工程简介
一、基因工程
表示特定基因操作操作，也可泛指所涉及的技术系统，其核心是构建DNA重组体的技术。
所以，基因工程和重组DNA技术有时也就成为同义词。
二、基因工程的发展简史
20世纪70年代 三项技术：DNA的 特异切割，
DNA的分子克隆
DNA的快速测序， 为基因工程奠定了基础。
1970~1978年 Smith和 Nathans等分离出特异切割DNA的限制 酶，绘制出DNA的限制图谱，提出修饰-限制酶 的命名法，并获得1978年的诺贝尔医学奖。
1972~1973年 Berg等最早组建成功DNA的重组体， BergCohen，Boyer等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性因子相融合，将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现DNA的分子克隆（clone）。

1975~1980年 Sanger实验室建立了酶法快速测定DNA序列技术，Gil-bert实验室又建立了化学测定DNA序列技术，并在1980年被授予诺贝尔化学奖，是重组技术系统得以产生。
1977~1982年 板仓（Itakury）等用人工合成的生长激素（somatostatin，SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品，之后，转基因植物和转基因动物的技术都有重大突破。
二、基因工程的操作过程
1、分离或合成基因；
2、通过体外重组将基因插入载体；
3、将重组DNA导入细胞；
4、扩增克隆的基因；
5、筛选重组体克隆；
6、对克隆的基因进行鉴定或测序；
7、控制外源基因的表达；
8、得到基因产物或转基因动物、转基因植物。
目的基因DNA的获取

• 化学合成法
• 从基因文库和cDNA文库中获取目的基因
• 逆转录法
• PCR方法
• RT-PCR(reverse transcription-PCR)
• 扩增目的cDNA
• DD-PCR(differential display-PCR)
• 寻找新基因的一种手段

三、微生物学与基因工程
可以说，基因工程的操作离不开微生物。
1、基因工程所用克隆载体主要是病毒、噬菌体和质粒改造而成。
2、基因工程所用的工具酶绝大多数从微生物中分离纯化得到的。
3、微生物细胞是基因克隆的宿主。
4、通常将外源基因表达导入大肠杆菌或酵母中，构建成工程菌，利用工厂发酵而得。
5、微生物的多样性，尤其是抗性，为基因工程提供了丰富的基因资源。
6、有关基因结构、性质和表达调控的理论也来源于微生物。
第二节、微生物与克隆载体

• 外源DNA片段进行克隆，需要合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。
• 以扩增外源DNA为目的的载体，称为克隆载体（cloning vector）。
• 克隆载体要求：

1、是一个独立的复制子（replicon），能复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增；
2、必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源基因的插入；
3、必须具有可供选择的遗传标记。
二、基因工程使用的载体
基本均来自微生物，主要有六大类：
质粒载体
噬菌体载体
柯斯质粒载体
M13噬菌体载体
真核细胞的克隆载体
人工染色体
三、基因克隆的载体：
质粒(Plasmid)；
质粒是细菌染色体外可以自我复制的双链环状DNA分子；
载体具备的基本条件：
能自我复制
分子量不宜过大
具有多个限制性内切酶的单一切点
具有选择的标记(如抗生素)
常用的有pBR322和 pUC系列。
四、克隆基因的表达
构建高效表达载体：
大肠杆菌表达系统的表达载体具有的主要元件可控制转录启动子，
翻译调控序列(合适的RBS和起始密码子)；
选择标记；
限制性内切酶位点；
首个用于在大肠杆菌中生产人生长激素的载体结构
pBR322的结构
pUC19
多克隆位点示意图
用l噬菌体作为克隆载体
Cosmid克隆载体的结构
粘粒文库构建步骤示意图
YAC载体的结构
第三节、微生物与基因工程工具酶

• 绝大多数基因工程所用的工具酶是从不同微生物中分离和纯化获得的。

一 、限制性内切酶（restriction enzyme）
又称限制性核酸内切酶，能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或附近切割DNA的一类内切酶。
根据限制酶识别和切割DNA的特点：
分为三种类型：

• 基因工程中应用II 型限制性内切酶。
• II 型限制性内切酶分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成，仅需Mg2+ 作为辅因子。
• 有专一识别位点与切割位点，特异性最强。

II型限制内切酶的基本特性：

• 识别序列通常由4~8个碱基对组成；
• 具有二重旋转对称轴；
• 这些碱基对的序列呈回文结构；
• 所有限制酶切割DNA后，均产生5’磷酸基和3’羟基的末端。
• 限制酶作用所产生的DNA片段有两种形式： 粘性末端和平末端。

同裂酶（isoschizomers）：
来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度等方面）。
同尾酶（isocaudomers）：
来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。
内切酶活性定义及功能纯度分析
单位活性定义：
一单位的限制性内切酶活性指在一定时间内(60分钟)，适当温度下，在50ul反应体系中，将1ug的底物DNA完全消化所需的酶量 。
单位活性依所用底物的不同而不同；使用其它底物时，应根据情况确定所用的酶量。
活性测定分析：
限制性内切酶活性测定是通过将不同稀释度的酶加入到含1ug DNA底物的适当缓冲系统中，在适当的温度条件下反应60分钟后，通过琼脂糖凝胶(含EB)电泳观察分析DNA样品，以完全切割带型的最高稀释度来计算活性单位 (u/ul )。
过消化分析：
过消化分析是作为酶纯度、非特异性内切酶、外切酶含量的一种指标。分析时，依次增加酶量加入到含有底物DNA的不同反应管中，在适当的温度下消化16小时后，通过琼脂糖凝胶(含EB)电泳确定得到完全清晰、无异常带型的最大单位数。
连接分析：
利用连接分析来确定限制性内切酶消化DNA后的功能性纯度。在适当的分析缓冲系统中，以4倍的过量酶完全消化底物DNA，然后用T4 DNA连接酶连接，再用同一种内切酶切割DNA。切-连-再切后的DNA用琼脂糖凝胶电泳进行分析，带型正常表明5'和3'末端的完整性及无核酸酶污染。
二、 DNA连接酶(DNA Ligase)

• 催化单链DNA 切口上5’-P 和3’-OH 形成磷酸二酯键
• T4 连接酶需ATP 、大肠杆菌连接酶需NAD 做为辅助因子

DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌
目前常用的三种体外DNA连接方法为：
1、用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段；
2、用T4DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段；
3、先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再进行连接。
加人工接头(含有限制性内切酶位点)
DNA Ligase 的作用
第四节、DNA的合成、体外扩增和定位诱变
一、 DNA的合成
已知某种基因的核苷酸序列，或某种蛋白质的氨基酸序列，可以用化学法合成这一基因。
DNA合成仪——在几个小时内可合成30~35个碱基的寡核苷酸。
目前，化学合成寡核苷酸片段能力为150~200个核苷酸左右。基因的化学合成是先合成许多寡核苷酸，彼此交换互补，然后再将它们连接起来。
合成的DNA分子广泛用于基因工程：
1、作为合成基因的元件，通过寡核苷酸片段连接，已能构建长达2000bp的基因序列；
2、作为核酸分子杂交的探针，通过核酸杂交用于检测和分离特殊的DNA序列；
3、合成引物，用于测序、定位诱变和PCR扩增等。
二、PCR扩增技术

1. PCR扩增技术即聚合酶链式反应（polymerase chain，PCR），是一种体外快速扩增特定DNA序列的新技术。
2. PCR由3个基本反应组成。

1、变性（denaturation）
加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。
2、退火（annerling）
使温度下降，寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。

3、延伸（extension）
在适宜条件下，引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
这样，变性、退火和延伸构成一个循环。新合成的DNA链又可作为模板进行下一个循环的复制。重复三步骤操作， DNA片段呈2的指数增长，在1~2h内重复25~30次循环，扩增的DNA片段拷贝数可增加106~107倍。
PCR扩增技术：
PCR技术的应用：

1. 应用于DNA的扩增和克隆：制备单链或双链DNA探针；还可以用于定位和DNA测序。
2. 临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。
3. 用于法医以鉴别个体和判定亲缘关系。用多对引物进行PCR时，可得到对个体特定的指纹图谱（ DNA fingerpinting）。

三、DNA的定位诱变

1. 人们能将外源基因导入生物体内，改变生物性状，而且已有可能通过体外定位诱变（site-directed mutagenesis）方法，特异改变克隆基因或DNA序列。
2. 定位诱变用合成的DNA和重组DNA技术在基因精确限定的位点引入突变，包括删除、插入和置换特定的碱基序列。

几种主要的定位诱变技术：

1. 寡核苷酸指导的诱变：

即合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有所需要改变的碱基，使与带有目的基因的单链DNA配对。
2、盒式诱变（cassette mutagenesis）：
就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。
3、PCR诱变：
在PCR方法中可看出只要引物带有错配碱基，便可使PCR产物的末端引入突变。
第五节、基因工程的应用及展望
一、基因工程药物
重组胰岛素（recombinant insulin）
重组疫苗（recombinant vaccines）
二、转基因植物
主要有两种类型：
二元载体系统（binary vector system）
由2个质粒组成，一个是克隆载体，一个是辅助质粒。
共整合载体系统 （cointegrate vector system）
由一个缺失了致瘤基因Ti质粒与一个普通穿梭质粒载体构建而成。

Ti-DNA结构
通过脓杆菌转化植物细胞得到转基因植物
三、转基因动物
通过微注射将DNA导入受精卵获得转基因动物
四、基因治疗（gene therapy）

1. 目前基因治疗大致有三类：

1、用正常基因去弥补有缺陷的基因，用于治疗遗传病。
2、通过转移基因以刺激免疫力，用于 肿瘤和艾滋病的治疗。
3、所转移的基因用于配合细胞或药物治疗，以便增强特异性或增强疗效。
五、基因工程在微生物研究中的应用
分子克隆和构建工程菌对了解微生物的结构与功能、微生物生理与代谢调节以及微生物生态等基本过程，提供最好方式。
六、基因工程研究展望

1. 基因工程与农业、林业的关系
2. 抗虫、抗病、抗逆境水稻的研究
3. 彩色棉的开发
4. 基因工程与制药
5. 基因治疗
6. 食用疫苗的开发
7. 基因工程与环境保护
8. 人类基因组计划与后基因组时代的来临
9. 以揭示蛋白质功能与结构研究重点的后基因组时代

第十二章 微生物的生态
本章提要：

1. 微生物生态学的研究内容
2. 微生物在自然界的分布
3. 微生物与其它生物的关系
4. 微生物与物质循环
5. 污水处理
6. 微生物甲烷的生成

一、微生物生态学的研究内容
1. 概念:
生态学是研究生命系统与环境系统相互作用及适应机理关系的科学。
2 . 微生物生态学研究内容：
微生物的群落结构；微生物与宏观、微观环境系统间相互作用的规律及其应用。
3. 方向 :
1）微生物在污染环境和环境保护中的作用
2）微生物生态研究方法的探讨
3）生态环境、种群分布规律
4）极端环境下的微生物的研究
5）探索宇宙微生物
微生物生态学已成为阐明生物进化，推动微生物分类，开发利用微生物及其遗传基因资源的理论基础，阐明其导致的物质与能量的转化机理，已广泛地用于农、工、医、环保及地球化学等领域。
二、微生物在自然界中的分布
（一）土壤中的微生物

1. 土壤环境适合微生物的生长：

pH，渗透压，通气，动植物尸体，矿质元素

1. 种类： 细菌>放线菌>真菌>藻类>原生动物

细菌多为异养类型；藻类为光能自养

1. 作用：在物质循环中起重要作用，降解土壤有机物。

（二）水中的微生物

1. 水环境：地球的70%左右由水覆盖，其中溶解和悬浮有机、无机物，流动水有氧渗入可供微生物生长。

v微生物种类：
水中有机物含量多少决定微生物种类。

1. 作用：在水生环境的食物链中起关键作用。

光合细菌 → 浮游生物 → 无脊椎动物 → 鱼类
（三）空气中的微生物

1. 环境：不利于微生物生长，所以无固定种类，
   种类分布：主要是真菌和细菌，在医院，公共场所致病菌的数量多。

科赫沉降法：打开皿盖5分钟进行培养，一般认为皿内100cm2上微生物的数量等于10m3空气中微生物的数量。

1. 作用：可迅速全球传播，对地球上生物繁衍有一定意义。

（四）生物体内外（以人为例）
1、正常菌群

1. 正常菌丛：生活在健康动物各部位，数量大、种类较稳定且一般是有益无害的微生物。
2. 条件致病菌：凡属正常菌群的微生物，由于机体防御性降低、生存部位的改变或因数量剧增等情况而引起疾病者。
3. 菌群失调：正常菌群由于某些外界因素的影响，使其中各种微生物间的相互制约关
   系破坏，能引起疾病。

2. 根际微生物和附生微生物
1）根际微生物：利用根系分泌的物质大量繁殖的微生物。
作用：加强土壤有机物分解，为植物提供养分； 分泌激素、维生素；产生抗
生素，抑制病源菌生长。
有害影响：与植物争夺养分、分泌有毒物质。
2）附生微生物：利用植物表面外渗和分泌物质为营养的微生物。
三、微生物与其它生物的关系

1. 互生
2. 共生
3. 寄生
4. 拮抗
5. 捕食
6. 竞争

1.互生：
两种单独分开生活的微生物共同生活时，可互为对方创造良好的生活条件，或一种微生物生命活动（代谢产物） 改善另一微生物的生活条件。

1. 微生物间：好氧异养固氮菌和厌氧自生固氮菌
2. 微生物与植物：
3. 微生物与动物

2.共生 （互生关系的发展）
两种微生物共同生活时互相依赖彼此获取一定利益，一种类型脱离另一种类型就不能独立生活。
共生关系是两种微生物紧密结合在一起，当这种关系高度发展时，就形成特殊的共生体，它们在生理上有一定的在形态结构上产生质的结构。
互利共生（mutualism）：是两者从结合中都有利。
偏利共生（commensalism）：是一方有利，但对另一方无害。
如：
地衣：是藻类和真菌共生体
根瘤菌与豆科植物也是共生关系。
反刍动物和瘤胃微生物等。
3.寄生：
一种微生物从另一种微生物中获得养料，藉以生长和繁殖，而本身又不给另一种生物任何好处的现象。 前者为寄生物，后者为寄主。

1. 专性寄生：
2. 兼性寄生：

如：噬菌体与细菌，蛭弧菌与细菌，均为寄生关系。
4.拮抗：
两种微生物生活在一起时，一种微生物产生某种特殊的代谢产物或改变环境条件从而抑制或杀死另一种微生物的现象。
5.捕食
6.竞争
四、微生物与物质循环
主要的有O、N、C、S、P循环
1、碳素循环
①有氧条件：
光合作用 : CO2　→　有机物
呼吸作用 ：有机物　→　CO2
②无氧条件：
酵解
甲烷生成
形成化石燃料
碳素循环：

2. 氮素的循环:
大多数微生物和植物可吸收的形式： NH4+、NO3- ，
①固氮作用：N2 → NH3
②氨化作用: 有机氮 → NH4+ + SO42- + H2O
③硝化作用:好氧时
两类细菌：硝化细菌： NO2- → NO3-
亚硝酸细菌：NH4+ → NO2-
④反硝化作用：在无氧条件下，硝酸盐还原菌的作用
⑤同化作用：无机氮转化成有机氮
氮素的循环:
（单线所示微生物特有的过程，双线所示为微生物和植物共有过程，粗线表示生物圈　氮循环中的重要环节）

3. 硫素的循环：
好氧时：硫细菌氧化
H2S、S → SO42-
厌氧时：硫酸盐还原菌
SO42- → S+H2S
硫素的循环:
自然界中的硫素循环
（双线表示植物和微生物共同进行的反应，单线表示仅有微生物进行的反应）

五、污水处理
（一） 污水的来源与类型：
1. 来源：工业、 农业、生活废水；
2. 类型：生理性污水、物理性污水、化学性污水、生物性污水。
（二） 废水的浓度指标：
1. 生化需氧量（biochemical oxygen demand, BOD）：
水中有机物在特定条件下（5天，20℃）被微生物等生物分解，所消耗的氧量，常以BOD5表示，单位为mg/l 或 ppm。
BOD借助于微生物消耗的氧量来间接地表示水中有机物的含量。
2. 化学需氧量（chemical oxygen demand , COD）：
指水中的有机物被强氧化剂氧化时所消耗的氧量，它间接表示了废水中全部的有机物的含量。
常用的氧化剂有：高锰酸钾，重铬酸钾表示为CODMn , CODCr
3.悬浮固体（suspended solid , SS）
指水中不能通过滤器的固形物。悬浮固体与水的透明度，浓度有关。在生活废水中，一般与BOD成正比。
4. 含氮化合物：

1. 废水中的氮主要是以蛋白质，氨基酸，硝酸盐，亚硝酸盐等形式存在，这些物质都可以作为微生物的氮源，所以含氮量作为一个重要的污染指标。
2. 实际工作中常以总氮量，或有机氮和氨态氮的含量作为测定指标。

（三）生物可降解性的评价：
1. 三元素比：C、N、P的比值最好146:16:3；
2. BOD/COD：测定废水的生物可降解性的最简便的方法；
若BOD/COD接近于1，则废水中可被生物降解的有机物占比例较越大，废水的生物可降解性越好。
BOD/COD ×100% >45% >30% <30% <25%
废水可降解性 较好 可进行 较难 不宜
3. 培养实验：直接测定有机物被生物降解的效果
（四）废水处理的类型：
1. 原理：主要根据水体自净原理，利用微生物酶的催化性和代谢活性，好氧或厌氧分解和转化污水中的污染物。
2. 类型：厌氧法
好氧法 生物膜法、活性污泥法、氧化塘法。
1）厌氧处理法
利用厌氧微生物（或兼性）在厌氧条件下分解污水的有机物，如甲烷发酵可在封闭式发酵池中进行。
2）好氧处理法
原则：借助一些特殊装置，通过人工或自然的方式供给氧气，用来强化和维持好氧微生物的活动，促使菌体分解利用废水的有机物。
方法：

氧化塘法：大面积敞开式的污水处理塘。利用藻菌共生系统来分解污水中的有机污染物，使污水得以净化。
活性污泥法：又称曝气法，是好氧微生物在通气条件下净化污水的方法。
活性污泥：由菌胶团形成菌、原生动物、有机和无机胶体以及悬浮物组成的直径为0.05—0.5毫米的绒絮状颗粒。可培养、驯化。

（五）微生物与环境监测：
1. 粪便污染指示菌：
①大肠杆菌群：指一群以大肠杆菌为主的兼
性厌氧G-杆菌
②大肠杆菌指数：1升水含有的大肠杆菌数
③大肠菌群值：以水样中可验出一个大肠菌
群数的最小毫升数表示，两者
有这样的关系：
大肠杆菌=1000/大肠菌群数
2．水体污染指示生物带：腐生菌/细菌总数

1. 自然水体中，腐生细菌的数量常与水体所含的有机物浓度成正比
2. 利用关系：一腐生细菌数，或腐生细菌数与细菌总数的比值，是划分污水或腐生水带的一个重要依据。

3. 致癌物与致突变物的微生物检测：Ames test
用于监测致突变物的微生物，主要有鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、红色面包霉、酿酒酵母、构巢曲霉等。

六、微生物甲烷的生成
（一）产甲烷菌的分类
1. 16SrRNA：16SrRNA分子一般被认为是一种形态进化过程中最保守的细胞结构，且在测定原核生物间系统发育的亲缘关系上是有用的。
2.细胞壁组成:无肽聚糖,细胞壁是由含氨基葡萄糖、中性糖和糖醛酸的异多糖。
3.类脂组成:产甲烷菌缺乏作为一般细胞壁特征的酯化磷酸，而优势则是由醚键合的聚类异戊间二烯链类脂。
4.代谢独特：不含SOD、过氧化物酶的专性厌氧菌。
（二）研究方法
1．厌氧培养分离
2．紫外荧光检测
3．气相色谱分析
4. 生态学研究

第十三章 微生物的分类和鉴定
概念:
微生物分类学：按微生物亲缘关系将其排成多种分类单位或分类群的科学。
分类：将有关个体的大量资料经科学的归纳整理或反映生物进化规律的自然分类系统。
鉴定：检测未知纯种微生物的多种性状特征，查找分类系统进行归类命名。
命名：为新发现的微生物按国际命名法给出一个学名。
一、微生物在生物界的地位
在生物学发展史上，生物的分类经历了：

1. 二界系统：
植物界：藻类 （光合作用、有细胞壁）
动物界：原生动物（细胞柔软、无细胞壁、无叶绿体、可运动）
2. 三界系统：
E.N.Haeckel提出三界系统，在二界上加上原生生物界，此观点直到本世纪初。
3. 四界系统：
植物界、动物界、原始生物界（原生动物，真菌，藻类）、菌界（细菌，蓝细菌）
4. 五界系统：
Whittaker（69年）提出 纵横统一五界学说，
纵：从原核 → 真核单细胞 → 真核多细胞
横：从光合营养 → 吸收营养 → 摄食营养
纵：反映细胞进化
横：反映营养方式进化
五界系统示意图

5. 六界系统：
我国王大耜，陈世骧等提出，病毒应单独一界
6. 三原界系统：
78年Whittaker和Marguilis提出三原界学说
古细菌原界（产甲烷菌，极端嗜盐菌，嗜酸嗜热菌）
真细菌原界（蓝细菌，除古细菌以外许多原核生物）
真核生物界（原生动物，真菌，动植物）
三原界的提出：
1）. 理论：70年代,Margulis的“内共生学说”认为：进化过程中，一种细胞捕抓了另一种细胞，未消化它，二者形成内共生 ，产生质的飞跃。

2）. 根据：基于古细菌的发现；16SrRNA碱基顺序的同源性
古细菌的特点
a. 细胞壁成分独特而多样：无肽聚糖
b. 细胞膜的类脂独特：不可皂化
c. 核糖体16SrRNA：顺序独特
d. tRNA成分：不含T
e. 蛋白质合成的起始密码：始于甲硫氨酸
f. 对抗生素的敏感性类似于：真核生物
g. 生态条件独特
三原界系统示意图

二、微生物的命名法
（一）分类单位：

1. 界、门、纲、目、科、属、种
2. 种是最基本的分类单位，
3. 每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科.....

1. 种：
种是一个基本分类单位，是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株的总称。
这里的种仅仅是指种的模式种或典型种
2．新种：
发表文章时，确定为新种，在学名后加sp.nov (species nova)或nov.sp。
3. 亚种：（subspecies, subsp, ssp）：
指某一明显而稳定的特征与模式种不同的种，有时称小种。
如：E.coli k12模式种（野生型）是不需要特殊aa的，而实验室变异后，可从k12获得某aa的缺陷型，此即称为E.coli k12的亚种或小种。
4. 型（form）:
同种微生物的各种类型。
如：血清型、抗原型
5．菌株（strain）:
又称品系：一种微生物的不同来源的纯培养物。
（二）命名
1. 双名法：
林奈创立。此为国际命名法规，即：每一微生物的学名都依属与种而命名
属名+种名+（首次定名人）+现定名人+定名年份
属名：拉丁文的名词或用作名词的形容词，字首大写，表示微生物的主要特点，由微生物构造，形状或由科学家命名
种名：为拉丁文形容词，为微生物次要特征，字首小写，为微生物色素、形状、来源或科学家姓名等。
如：Escherichia coli
当文章中前面已出现学名时，后面可将属名缩写成一至三个字母。 如:E.coli
2．三名法：
种名后面加亚种，亚种可用正体
如：Staphylococcus aureus subsp
3．属名+sp(ssp)，表示种名未定。
三、分类依据
（一）形态特征：大小，排列，分化，结构，染色等
（二）培养特征：营养要求，生长的物理环境（酸碱度，温湿度），菌落，菌苔，液体培养特征。
（三）代谢特征：微生物生命活动的方式。如：I.M.Vit
（四）化学组成特征：细胞主要特征性化学成分的鉴定如：细胞壁成分、细胞内含物
（五）抗原特征：抗原成为化学组成的一个特殊方面，微生物具有许多不同类型的抗原。
（六）生态特征：与其他生物的关系、自然界的分布、致病性等
现代分类依据还需补充：
（七）细胞壁成分：
（八）GC含量
某一特定种的DNA碱基组成是恒定的。GC含量以碱基全部克分子中G和C的摩尔百分数表示：
G + C
——————×100% =（G +C）mol%
G + C +A +T
所得数值范围从23～75

1. 种内各株可差2.5~4.0% ;若相差< 2%为同种。
2. 不同种相差5%以上；若相差> 10%为不同属。

方法：解链温度法
原理：

• 一定pH和离子强度下加热DNA，氢键打开；
  
• 在260nm处，随着温度增加，双链变单链导致紫外吸收增加，引起增色效应。增色效应一半时的温度（热变性温度，Tm ）可反映出不同的DNA中的（G+C）%值。 Tm=69.3+0.41*(G+C)%


（九）DNA杂交法：
原理：根据DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性。
若同源性70%以上为种的水平，20%以上可能是属的水平。
(十）16SrRNA
在30多亿年生物进化的漫长历史中始终执行着相同的生理功能，所以碱基顺序变化很少，所以称其为保守结构。
四、常用分类方法：

• 经典分类法：将形态、结构特征作为初步特征，再比较生理、生化特征，采用双歧法整理结果，进行分类。
• 数值分类法：根据数量特征进行分类，可根据50~60个或100以上，用电脑进行计算统计。
• 遗传分类法：主要依据GC含量及DNA杂交试样为依据。

第十四章 微生物物种的多样性

微生物多样性是生物多样性的重要组成部分，而且有独特之处，起着不可替代的作用。
第一节、原核微生物物种多样性
中国地域辽阔，地形、气候、土壤和植被等自然条件极为复杂多样，这些决定了中国微生物物种群必然丰富多彩，但是由于中国微生物资源尚未进行全面调查研究，目前在中国科学院微生物菌种保藏中心(非医学微生物保藏中心)保藏的细菌60属，266种，2003株，其中绝大部分是从各省土壤、水域和动、植物样品中分离获得的，有一定代表性，在工农业生产中使用能增产的菌株。
一、放线菌
目前国际上已经描述和发表的放线菌近60个属、2000多种，中国已对40个属中的一部分种进行过分类研究，现保藏有36个属，450种，1332个菌株；其中8个属是中国研究工作者描述和建立的，它们是：
类链霉菌属 (Streptomycoides)、
小链孢菌属(Microstreptospora)、
异壁放线菌属(Actinoallotaichus)、
三歧泡菌属(Trichotomous)、
双孢放线菌属(Actinobispora)、
游动四孢菌属(Planotetraspora)、
动孢链霉菌(Streptoplanospora)、
白黄孢囊菌属(Cathayosporangium)。
二、Frankia-共生固氮放线菌
Frankia是一类能与许多木本植物共生的结瘤固氮的放线菌，与这类菌共生的寄主植物广泛分布于世界各地，1978年组织了多学科协作研究，开展了全国放线菌结瘤植物调查，查明中国有6个属44个种的树木与放线菌共生结瘤固氮，其中19种是国际上未报道的新记录种 。
表1 中国新发现放线菌结瘤树种

四川桤木 Alnus cremastogyne 宜昌胡颓子 E. henryi
滇桤木 A. ferdinandi 大果沙枣 E. moorcroftii
东北赤杨 A. mandshurica 翅果油树 E. mollis
西伯利亚赤杨 A.sibirica 多花胡颓子 E.mulliflora var.ovata
马桑 Cariaria sinica 黄果沙枣 E. oxycarpa
草马桑 C. terminalis 星毛胡颓子 E. stellipila
长叶胡颓子 Elaeagnus bockii 小叶木半夏 E. umbellata var. pavifolia
可木胡颓子 E. commutata 角花胡颓子 E. gonyanthes
秋胡颓子E. crispa 矮杨梅 Myrica nana
高沙棘 Hippophae rhamnoides var. porcera
三、根瘤菌
根瘤菌与豆科植物共生结瘤是陆生生态系统中最重要的供氮体系，它们在所有固氮体系中固氮作用最强，全世界估计有18000～9000种豆科植物，中国已记录了1500种。绝大多数豆科植物能与根瘤菌共生结瘤固氮。目前国际上已描述的根瘤菌有4属15种。
根据全国根瘤菌资源调查
已纯化根瘤菌近2000株，并建立了一个新属中华根瘤菌(Sinorhizobium),包括两个新种。另外,在紫云英结瘤的根瘤菌已定名为华癸根瘤菌(Rhizobium huakuii),从新疆干旱地区发现一个新种定名为天山根瘤菌(Rhizobiumtianshanellse)。从大豆中分离出超慢速生长的大豆根瘤菌定名为辽宁根瘤菌(Bradyrhizo-bium liaoningense)新种，中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)是在中国最近发现的一个新属。
四、古生菌的多样性
古生菌发育树


系统发育树的根部：是目前尚不可培养的超嗜热古生菌——古生古菌界。由根部向上可分为4个亚群：
第1亚群 近根部的甲烷嗜热菌以及能还原硫的超嗜热古生菌，包括：硫还原球菌，硫化叶菌，热变形菌．热网茵，热球菌，它们统称为泉古生菌界(Crenarchaeota)，超嗜热菌的寡核苷酸标记是UAACACCAG和CACCACAAG。
第2亚群 产甲烷古生菌，包括：产甲烷球菌、产甲烷杆菌、甲烷嗜热茵、古生球菌以及产甲烷八叠球菌—产甲烷螺茵类群。AUUAAG序列是极端嗜热茵的标记
第3亚群 极端嗜盐的古生菌独立成群、包括：盐杆菌—盐球菌，AAUUAG序列是极端嗜盐菌的标记。
第4亚群 嗜酸、嗜热的热源体也是独立成群，AAAACUG和ACCCCA寡核苷酸序列是热源体的遗传标记。谱系树中的第2亚群，第3亚群和第4亚群构成了广古生菌界(Euryarchaeota)

第二节、真核微生物
一、中国真核微生物
真核微生物有：粘菌、真菌、卵菌三大类。
英国、芬兰、瑞士等国家的研究资料表明，
真菌与维管束植物已知种数存在4:1至6:1的数目比例关系。中国维管束植物近30000种，若按6:1的比例推算，真菌种数可达18万种，占世界的15％。1982～1994年中国发表的新种共600余种，平均每年50种，仅为全世界每年发表的新种数(1986～1990年每年平均1700种)的2％；同期发表的新记录有1100余种，平均每年92种，若按每年增加新种和新记录150种计，中国需要1300年才能把全部种类调查清楚。
二、中国真核微生物的已知种数
中国已发表的粘菌、真菌和卵菌的种名数超过10000，但其中存在不少同物异名的情况，实际可承认的种约8000种左右，仅占估计种数4％，占全世界已知种数(70000种)的11％，其中粘菌约260种、真菌7500种，卵菌300种。
三、中国真核微生物各类群的多样性
菌物界已知的约100个目中，半数以上在中国尚无人进行研究。在20余个已有人进行研究的目中，大半仅涉及其中若干科或属。
海洋真菌和卵菌在中国基本上没有资料，仅有零星的有关海洋酵母的调查报告，生活在淡水中的真菌种数仅有零星的有关卵菌(主要是水霉和腐霉)的报告。
水生丝孢菌的研究刚刚起步仅知50余种(全世界200余种)，虫生真菌仅知180种(全世界已知900种),据研究得较好的曲霉属(Aspergillus)，已知有89种(全世界已有350个名称)，青霉属(Penicillium)约70余种(全世界有96种)。外生菌根菌已知有29科68属642种，其中担子菌类22科59属612种，子囊菌类7科9属30种。内生菌根菌(VA菌根菌)已报道的约40种。地下菌(俗称块菌和假块菌)，有极高的商品价值，全世界已知1000多种，而中国已报道的仅有60余种。
其他的在植物组织内的内生真菌，寄生、共生或共栖在蜘蛛、多足类、甲壳类、水生昆虫、海洋浮游生物和草食哺乳动物胃里的真菌在中国基本无人研究。
第三节、极端环境下的微生物
中国西北干旱和半干旱地区分布有许多内陆盐湖和盐碱湖。这些内陆盐湖中具有非常丰富的极端嗜盐和极端碱性嗜盐菌(古细菌)以及耐碱、耐盐和嗜碱微生物资源。有些碱性菌株已经或即将用于生产。
在中国的嗜盐和碱性嗜盐古细菌中除了国际公认的典型菌株外，在西北地区还发现了新的菌种，如Haloarcula aidinensis，该菌是在新疆低于海平面154m的盐湖中发现的，细胞多形态、三角型和方型同时存在 。
全国各地分布有众多温泉和高温泉， 特别是西南部地区温泉尤多，温泉中蕴藏着许多耐热和嗜热微生物种类，如1982年报导的嗜酸热硫球菌属(Sulfosphaerellus )也属古细菌生长最适温度70℃。
在中国的高山雪线以上地区还发现若干耐低温微生物。中国丰富的极端环境中的微生物将为中国传统微生物产业的改革，提供丰富的有用微生物资源。

第四节、微生物资源现状
一、微生物受威胁状况
毁林造成生态破坏进而殃及微生物的状况在中国尚不清楚，目前还不可能发布《中国微生物红皮书》。一些野生食用和药用菌，由于过度采收造成资源日益枯竭的状况也没有引起重视。
例如冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，
仅分布中国青藏高原高海拔地区，50年代前后年产在20000kg以上，由于严重滥采，产量逐年下降，真品少，掺杂不少霍克斯虫草(Cordyceps hawkesii)或其他虫草 。
“口蘑”(Tricholoma mongolicum)
为著名草原野生食用茵，分布于河北北部、东北西部和内蒙等地区，曾大量出口；近年来，由于过度放牧和乱采滥收，此茵在其分布南界张家口地区已基本不见踪影，在重要产地呼伦贝尔草原，产量也急剧下降，1991年内蒙古“口磨”几乎没有收购。松茸(Tricholoma matsutake)分布于中国长白山、小兴安岭及西南地区，产品远销日本，近年来由于过量采收，数量日趋减少。
药用马勃类真菌
如紫色马勃(Calvatia lilacina)等，主要出产于北方草原，同样也出现了自然资源日益枯竭的现象。
二、中国微生物多样性的保护
中国已建立的数百处自然保护区同时也为真菌提供了就地保护的良好场所。然而绝大多数现有保护区对真菌区系缺乏专门调查，缺乏真菌分布、组成特点和所受威胁的系统资料。因此，在各保护区开展真菌区系调查是中国生物多样性保护工作中极为紧迫的任务。
发展林业是木生食用菌、药用菌、菌根菌和地下块菌资源可持续利用的根本保证，与此同时要实行计划采收，以达到保护资源，林菌并举，获得最佳经济效益的目的，也是就地保护微生物资源和多样性的有利措施。
菌种保藏是迁地保护的一种方法。
中国科学院微生物研究所菌种保藏室共保藏菌种1万余株。细菌、放线菌菌种保藏情况已如前述。关于真菌，计酵母菌51属、166种、1877株；小型丝状真菌178属、714种、4705株；蘑菇类63属113种662株;共计993种7244株。
其他重要的菌种保藏单位尚有中国农业科学院和中国林业科学院等。
目前中国菌种保藏工作跟实际需要还有很大距离，应该结合物种多样性调查对各种野生菌进行分离、培养和保藏。

第五节、病毒
中国学者对植物病毒、动物病毒、昆虫，病毒和噬菌体等生物类群进行了广泛研究。
例如中国分离纯化的昆虫病毒
占约世界报导的昆虫病毒的14％，在植物病毒研究中也有中国报导的新种，如中国蕃茄黄化曲叶病毒、苹果锈病类病毒(此病毒经分子生物学研究表明与马铃薯块茎病毒同源)等。中国烟草曲叶病毒和南瓜曲叶病毒均为双生病毒，经外壳蛋白基因序列分析证明它完全不同于美国的南瓜曲叶病毒。
到目前为止，不包括医学
病毒在内，中国共保藏病毒600余株，其中动物病毒146株、
植物病毒151株、
昆虫病毒214株、
噬菌体91株。

第十五章 感染与免疫
感染（infection）：又称传染，是机体与病原体在一定条件下，相互作用而引起的病理过程。

第一节、感染的一般概念
一、感染

• 有病原体
• 有传染性
• 有流行性、地方性和季节性
• 有免疫性
• 感染途径来源于宿主体外为外源性感染；宿主体内的正常菌群失调引起的感染称内源性感染。

传染病的基本特征：

• 有病原体
• 有传染性
• 有流行性、地方性和季节性
• 有免疫性

二、感染的方式和部位
常见的有呼吸道感染；消化道感染；创伤感染；接触感染；垂直传播等。
不同的病原体侵入机体的途径不同。

• 肝炎病毒只侵袭肝细胞；
• 肺炎球菌侵袭呼吸道粘膜；
• 极少数（如血吸虫、钩虫）病原体能穿过皮肤
• 绝大数病原体通过机体的创伤或静脉注入、外科切口等医源性的途径进入机体内部。

三、微生物的致病性
1、细菌的致病性：
是对特定宿主而言。病原菌致病力的强弱称为毒力，其侵袭力和毒素是构成毒力的基础。
侵袭力（invasiveness）：
病原菌突破宿主防线，并能于宿主体内定居、繁殖扩散的能力。
毒素（toxin）

• 外毒素—细菌在生长过程中合成并分泌到胞外的毒素。如，肠毒素，破伤风痉挛毒素，白喉毒素等。
• 内毒素—即G-细胞壁脂多糖（LPS），菌体裂解时释放，作用于白细胞、血小板、补体系统，凝血系统和体液系统等，引起发热、白细胞增多，血压下降及微循环障碍等，毒性较小。

2、病毒的致病性

• 病毒感染是基因水平感染。病毒在宿主细胞内增殖，影响宿主细胞的核酸及蛋白质代谢。有三种类型：
• 杀细胞感染（cytocidal infection），如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、腺病毒等；
• 稳定状态感染（steady state infection），如甲肝病毒等；
• 整合感染（integrated infection），如人类多瘤病毒（BKV、JCV）和人类逆转录病毒（HTLV—1）。

3、立克次氏体的感染

• 通过节肢动物叮咬或粪便传播感染；
• 致病物质有内毒素和磷脂酶A等；
• 释放的立克次氏体通过血流在全身各器官的小血管内皮细胞中增殖，引起血管炎症。

4、真菌的致病性
不同真菌可通过不同方式致病：
（1）、致病性真菌感染
一些外源性真菌感染可引起皮肤、皮下和全身疾病。如皮肤癣菌有嗜角蛋白特性，引起局部炎症和病变。
（2）、条件致病性真菌感染
主要由一些内源性真菌，在机体免疫力降低时引起感染。如白色念球菌是人体正常菌群，人体免疫力低下，引起皮肤粘膜的口角糜烂、肺炎等。
（3）、真菌变态反应性致病
有些真菌不致病，但对某些过敏倾向的个体可引起变态反应性疾病。如引起哮喘、鼻炎等。
（4）、真菌性中毒
人或动物食用因真菌或真菌毒素污染的食物，造成中毒现象。如青霉菌产生的灰黄霉素可诱发小鼠甲状腺和肝肿瘤。
5、寄生虫的致病性

• 寄生虫的构造和成分都很复杂。
• 寄生虫的生活史很复杂。
• 寄生虫分为原虫和糯虫。原虫是单细胞生物，多数于胞内寄生；糯虫是多细胞生物，种类很多，通常引起胞外慢性感染。如：血吸虫。

四、免疫（immunity）
是生物体能够辨认自我与非自我，对非我作出反应以保持自身稳定的功能。
免疫是生物在长期进化过程中逐渐发展起来的防御感染和维护机体完整性
的重要手段。
1、宿主免疫防御功能：

• 分非特异性免疫和特意性免疫两大类；
• 两者相辅相成，共同完成抵抗感染、保护自身机体的作用；
• 有时会造成对机体的病理性损伤。

2、免疫功能
细胞的免疫性主要是由于细胞膜上有专一性的抗原受体，当抗原受体被抗原激活后，即产生相应的抗体。抗体能够识别及特异性地与外源性抗原（如细菌、病毒等）结合并吞噬消灭。另外，吞噬细胞和淋巴细胞的免疫功能，是由于它们能够识别外源物质（细菌或其它蛋白质等），并能将这些外源物质吞噬消灭。

第二节、宿主的非特异性免疫
（non-specific immunity）

• 是机体的一般生理防卫功能，又称天然免疫（innate Immunity），是遗传特性，是种系发育过程中形成的。
• 主要包括

生理屏障—皮肤、粘膜及其附属物、共生菌群
细胞因素—溶菌酶、补体、干扰素
体液因素—吞噬细胞、自然杀伤细胞
其他—免疫的综合作用等
一、生理屏障
表面屏障：
连续、完整的皮肤结构，其外面的角质层是坚韧的、不可渗透的，组成了阻挡微生物入侵的有效屏障。
局部屏障：
体内某些部位具有特殊的结构而形成阻挡微生物和大分子异物进入的局部屏障。如血脑屏障、血胎屏障
共生菌群：
人体中存在的大量菌群，互相间的拮抗作用和产生的抑制物抑制多数具有疾病潜能的微生物生长。
感染的生理屏障
二、体液因素
1、补体系统（complement system）
包括20余种蛋白质成分，主要有肝细胞和巨噬细胞产生，通常以无活性形式存在于正常血清和体液中。
补体激活：在一定条件下促发补体系统的一系列酶促级联反应。有两条途径，经典激活途径（classical pathway CP）和替代途径（altemative pathway AP，即旁路途径）
补体的命名：
C代表补体，各成分用数字分别命名C1-C9，旁路途径成分命名为B因子和D因子；各成分被裂解后产生的片段依次加上英文小写字母A、b、c等，具有酶活性或其他生物活性的成分在其上划一横线表示C4b2a；灭活后可在其旁边加i，如C3bi。
补体的功能

• 有复杂的免疫调节功能，参与机体的特异性免疫。
• 补体片段是通过受体发挥作用。
• 补体各片段均有自己的特异性受体，广泛分布在多种细胞。

补体的功能

• 有复杂的免疫调节功能，参与机体的特异性免疫。
• 补体片段是通过受体发挥作用。
• 补体各片段均有自己的特异性受体，广泛分布在多种细胞。

干扰素（interferon，IFN）

• 天然干扰素是宿主细胞在病毒等多种诱生剂刺激下产生的一类相对分子质量低的糖蛋白。
• 分α，β，γ三组，α、β干扰素分别由白细胞和成纤维细胞产生，属I 型干扰素；γ干扰素主要有T淋巴细胞产生，又称II 型干扰素或免疫干扰素。
• 有抗病毒增殖活性、免疫调节活性、细胞分裂抑制活性、抑制肿瘤生长活性和改变细胞膜生物学特性等功能。

溶菌酶（lysozyme）

• 是不耐热的碱性蛋白，主要来源于吞噬细胞并可分泌到血清及各种分泌液中，能水解G+胞壁肽聚糖而使细胞裂解。
• 体液中还有 溶解素（B-lysin）、转铁蛋白、血浆铜铁蛋白等多种能杀菌或抑菌因素，仅在机体免疫中起辅助作用。

三、细胞因素

• 吞噬细胞（phagocytes）：

有大、小吞噬细胞两类。大吞噬细胞即居留于各种组织中的巨噬细胞和其前体—血液中的单核细胞；小吞噬细胞主要指血液中的中性粒细胞。

• 自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）

属于淋巴细胞，分布于外周血和脾脏，具有不须事先致敏，不须其他辅助细胞或分子的参与而直接杀伤靶细胞的功能。
四、炎症（inflammatory）

• 是机体受到有害刺激时所表现的一系列局部和全身防御应答，可以看作是非特异性免疫的综合作用结果。
• 有害刺激包括各种理化因素，但以病原微生物感染为主。
• 炎症的作用为清除有害异物、修复受伤组织、保持自身稳定性。

第三节、宿主的特异性免疫
一、特异性免疫（specifie immunity）
是机体在生命过程中接受抗原性异物刺激后产生的，又称获得性免疫（acquired immunity），具有获得性、高度特异性和记忆性。
1、特异性免疫的类型
自动免疫 本身接受刺激产生，维持时间长。
被动免疫 从外界获得免疫力，维持时间短。

2、免疫系统（immene system）
由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。
（1）、 免疫器官
按其功能又分为中枢免疫器官和周围免疫器官。
中枢免疫器官是免疫细胞发生和分化的场所。包括骨髓、胸腺和鸟类的法氏囊。骨髓是成血干细胞（包括免疫祖细胞）发生的场所。胸腺是T淋巴细胞发育的场所，法氏囊是B淋巴细胞发育的场所。周围免疫器官是免疫细胞居住和发生免疫应答的场所。

• 有淋巴结、脾脏和黏膜相关淋巴组织。

（2）、免疫细胞
有淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞和单核巨噬细胞、树突状细胞。广义还包括红细胞和血小板及其各类细胞的祖细胞。均来自骨髓多能造血干细胞。P387页。
（3）、免疫分子
免疫分子包括膜表面免疫分子和体液免疫分子。
膜表面免疫分子：包括膜表面抗原受体、主要组织相容性抗原、白细胞分化抗原和粘附分子。
体液免疫分子：主要包括抗体、补体和细胞因子。细胞因子直接参与免疫应答的效应过程。补体和抗体分别是非特异免疫和特异免疫的主要体液部分。
（4）免疫系统的功能
免疫是机体的一种保护性反应，其作用是识别和排除抗原性异物并对自身成分耐受，以维护机体的生理平衡和稳定。


二、抗原和抗体
（一）、抗原（antigen，Ag）
从现代免疫学观点来看，抗原是能诱导机体产生体液抗体和细胞免疫应答，并能与抗体和致敏淋巴细胞在体内发生特异结合反应的物质。

• 某些低分子量的物质可以与抗体结合，但它们本身不能刺激抗体的产生。如果它们与大分子紧密结合，则能刺激抗体的产生。这些小分子物质称为半抗原(hapten)。
• 几乎所有外来的蛋白质都是抗原，并且每种蛋白质都能诱导特异抗体的产生。一个人体内在任一个给定时刻大约有10000种抗体存在。

1、抗原的特性

• 免疫原性（immunogenicity）：抗原在体内激活免疫系统，产生抗体和特异效应细胞。
• 免疫反应性（immunoreactivity）：

或反应原性，抗原能与相对应的免疫应答产物（抗体及致敏细胞）发生特异结合和反应的能力。

• 完全抗原（complete）：

又称免疫原（immunogen），大多数蛋白质、细菌、病毒都是完全抗原。

• 不完全抗原（incomplete antigen）或半抗原（hapten） ，只有反应原性而没有免疫性的抗原，绝大多数寡糖，所有脂类及简单的化学药品由此特性。

2、抗原决定簇（antign degerminant）

• 又称表位（epitope）是抗原物质上能够刺激淋巴细胞产生应答并与其产物特异反应的化学基团。
• 是抗原特异性的物质基础。
• 抗原所携带抗原决定簇的数目称为抗原价，一般抗原是多价的。

3、影响抗原性的因素

• 异己性 正常情况下机体的免疫系统对自身成分或细胞不发生免疫应答。
• 理化性质 相对分子质量越大，结构越复杂的物质含有较多的抗原决定簇，其免疫性越强。

4、抗原的种类

• 抗原极为繁多，根据刺激机体B细胞产生抗体是否需要T细胞辅助，分为：胸腺依赖性抗原（thymus dependent antigen，TDAg）和非胸腺依赖性抗原（thymus independent antigen，TIAg）
• 根据抗原的性质可分为：蛋白质抗原、多糖抗原、脂抗原、核酸抗原。
• 根据抗原与机体的亲缘关系可分为：异种抗原、同种异型抗原和自身抗原。还有其他分类。
• 通常蛋白质为完全抗原；而类脂质、寡糖和核酸为半抗原。

根据抗原的来源：

• 分为天然抗原和人工合成抗原。
• 天然抗原又可具体分为组织抗原、细菌抗原、病毒抗原。

（二）、抗体（antibody，Ab）

• 又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是机体在抗原物质刺激下所形成的一类与抗原特异结合的血清活性成分。
• 抗体是由B细胞合成并分泌的物质。

1、免疫球蛋白

• 免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白(serum glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白质与糖是共价联接的。
• 免疫球蛋白是被脊椎动物作为抗体合成的。它的合成场所是网状内皮系统的细胞。这些细胞分布在脾、肝和淋巴节等组织中。
• 当一类外来的被称为抗原的物质，如多糖、核酸和蛋白质等侵入机体时即引起抗体的产生，这就是所谓免疫反应。抗体就是免疫球蛋白。

2、抗体的特点

• 抗体具有两个最显著的特点，一是高度特异性，二是多样性。
• 高度特异性就是一种抗体一般只能与引起它产生的相应抗原发生反应。抗原—抗体复合物往往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来，此即“沉淀反应”。在体外，沉淀反应已被广泛用于研究抗原—抗体反应，并成为免疫学的基础。多样性就是它们可以和成千上万的各种抗原(天然的和人工的)起反应。
• —般说来，一个抗原与接受该抗原的动物关系愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应也愈强。

3、Ig的基本结构与分类

• 呈Y字型，两条长的多肽链称为重链（heavy chain ，H链，）短的称为轻链（light chain，L链）。
• 轻链由两个功能区，N端区其氨基酸序列多变（可变区VL），C端区氨基酸序列保守（稳定区CL），重链由一个N端V区和3~4个C端稳定区组成。
• H与 L， H 与H之间均由二硫键相连。重链间二硫区域为绞键区，酶切后有三个片段。P391。

按照C区氨基酸序列及其抗原性的差异

• 重链分为μ、γ、α、ε、σ五类，其相应组成的Ig分别为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD。
• IgM是由五个单体经连结链（joining chain，J链）连结的五聚体； IgA由J链连结二个单体而成。
• 有的类还有亚类，如IgG分为IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4等。

按照Ig存在方式分为两种：

• 膜型（membrane Ig，mIg）；存在于B细胞表面，是B细胞的特异性抗原受体。
• 分泌型（secretory Ig，sIg）；分泌型Ig进入血液、组织和分泌液中，即为经典的抗体。

Ig的生理功能

• 与抗原特异结合 Ig的首要功能是识别抗原。
• 激活补体 。
• 结合细胞。
• 通过胎盘。

三、B细胞介导的体液免疫
人类B 细胞来源于多能造血干细胞，在骨髓中发育成熟。成熟的B 细胞居留于脾脏和淋巴结的发生中心及粘膜相关淋巴组织，并部分参与淋巴再循环。
由B 细胞分泌抗体介导的免疫应答为体液免疫（HI）。
B 细胞应答又分为依赖于T细胞和不依赖于T细胞两类，由抗原的性质决定。

1、依赖于T细胞的体液免役B细胞对TD抗原的应答
2、T非依赖性体液免疫应答

• 是对TI抗原的应答，TI抗原分为两类。I型TIAg，如LPS，具有有丝分裂原性质，与丝裂原受体结合时，可非特异激活B细胞。II型TIAg，如肺炎球菌多糖，有多个一定间隔的重复表位，可与B细胞表面多个mIg结合，从而活化了B细胞。
• 浆细胞是B细胞发育的终末阶段，高效而短命。

3、抗体产生的一般规律

• 初次应答与再次应答。
• 初次应答有一周以上的潜伏期，产生的抗体以IgM为主。
• 再次应答的潜伏期缩短，抗体水平上升，抗体类型以IgG为主，产生免疫记忆。

四、T细胞介导的细胞免疫

• T细胞来源于骨髓多能造血干细胞，在胸腺内发育成熟为胸腺依赖性细胞—T细胞。
• 成熟T细胞居留于淋巴结、脾脏的T细胞区，也是主要的循环淋巴细胞。
• T细胞表面有特异的抗原识别受体（TCR），但不能直接识别天然抗原，必须经过辅助细胞的加工处理。
• 活化T细胞产生的特异杀伤或免疫炎症称为细胞免疫（CMI）。

五、联合抗感染免疫
机体对大多数致病微生物的应答是复杂的，涉及多种免疫机制的联合，天然免疫与获得性免疫，体液免疫与细胞免疫均是机体免疫功能的有机部分。
六、克隆选择和免疫耐受性
是能够区分自己与非己是免疫的基本特性。正常机体不会对自身成分产生免疫应答，成为自身耐受。
T、B细胞在中枢免疫器官经过克窿选择获得的自身耐受性称为中枢耐受。
六、克隆选择和免疫耐受性

第四节、免疫病理

• 超敏反应
• 自身免疫病
• 移植免疫
• 免疫缺陷
• 肿瘤免疫

由于各种原因引起免疫应答反应过强或反应异常，造成机体损伤或功能障碍时，称为超敏反应（hypersensitivity）。
在某些情况下此种自身耐受被打破，机体免疫系统对自身成分产生免疫应答而造成病理性损害，则称为自身免疫病。自身免疫病有一定遗传倾向。
器官移植的受者将移植器官当作异物产生免疫应答进行杀伤清除，称为宿主抗移植物反应（host versus graft reaction，HVGR）。
含有免疫活性细胞的组织植入有免疫缺陷的受者时，移植物不遭排斥但对宿主细胞产生免疫损伤，称为移植物抗宿主反应（GVHR）。

第五节、免疫学的应用

• 抗体的制备及应用
• 免疫学技术
• 免疫预防

一、抗体的制备及应用

• 血清抗体：传统用纯抗原使血清中产生特异性抗体—抗血清或免疫血清；也可将血清抗体提纯为精致免疫球蛋白。但血清抗体因抗原不同，是具不同特异性的多克隆抗体混合物。
• 单克隆抗体：是由单个B细胞增殖所产生的抗体，抗体的氨基酸序列、类型、抗原特异性等生物学性质均相同。
• 基因工程抗体：有嵌合抗体、单链抗体、重组抗体和抗体库与噬菌体抗体。

二、免疫学技术（免疫诊断学）

• 血清学技术：抗原抗体可与体外特异性结合，有凝集反应、沉淀反应。
• 免疫标记技术（三大标记技术）：免疫荧光技术、放射免疫测定和免疫酶技术。
• 生物素—亲和素系统：

三、免疫预防

• 人工免疫：人为给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或输入免疫细胞及分子，使获得抵抗力，称为人工免疫。
• 人工自动免疫：即预防接种。
• 人工被动免疫：输入免疫血清或致敏淋巴细胞及其制剂或细胞因子，使机体获得一定免疫力，达到防止某些疾病的目的，称为人工被动免疫。

煤气中毒的机制
一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。